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上一期小果跟大家嘮了單細(xì)胞測序的建庫流程，那么這一回，咱們來嘮嘮單細(xì)胞計數(shù)矩陣的生成。

上回書說到，在建庫時，單細(xì)胞測序通過barcode區(qū)分來源不同細(xì)胞的RNA序列，但是在同一個細(xì)胞中，同一基因可能會產(chǎn)生多次轉(zhuǎn)錄，而PCR步驟也會產(chǎn)生重復(fù)讀取。為了區(qū)分reads是來源于生物擴增還是PCR擴增，scRNA-seq采用在PCR擴增前在cDNA序列上引入UMI標(biāo)記，確定單個cDNA擴增過程中產(chǎn)生的拷貝數(shù)。因此scRNA-seq的數(shù)據(jù)處理有以下幾種可能

相同轉(zhuǎn)錄本但UMI不同的reads來源于同一細(xì)胞不同的分子，屬于生物學(xué)重復(fù)，每個reads都應(yīng)當(dāng)被計算。

具有相同UMI的reads來源于同一分子的PCR重復(fù)，應(yīng)當(dāng)被即為單個reads。

如圖所示，ATCB應(yīng)當(dāng)被記為單詞reads，而ARL1應(yīng)當(dāng)分別計數(shù)。

了解UMI的原理，有利于我們了解scRNA-seq如何在細(xì)胞水平上進(jìn)行量化。

在了解了UMI和barcode是如何區(qū)分不同細(xì)胞和不同分子后，接下來咱們來了解以下scRNA-seq的工作流程。

工作流程步驟為：

計數(shù)矩陣的生成：formating reads, demultiplexing samples, mapping and quantification

原始計數(shù)矩陣的質(zhì)控：過濾劣質(zhì)細(xì)胞

聚類：基于轉(zhuǎn)錄活性的相似性對細(xì)胞進(jìn)行聚類（細(xì)胞類型?類似于?不同的clusters）

marker鑒定和簇注釋：識別每個簇的marker并注釋已知的細(xì)胞類型簇。

工作流程如下圖所示：

當(dāng)然，無論進(jìn)行什么分析，基于不同條件的單個樣本得出的關(guān)于總體的結(jié)論都是不可信的。若想得到可靠的結(jié)論，仍然需要生物重復(fù)！也就是說，如果您想得出與總體相對應(yīng)的結(jié)論，請做生物學(xué)重復(fù)。

在完成了測序后，原始測序數(shù)據(jù)一般輸出為BCL或FASTQ格式。如果reads是BCL格式，可以使用cellranger的mkfastq工具將BCL轉(zhuǎn)換為FASTQ格式。

在得到FASTQ文件后，使用cell ranger軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和定量，可以通過下圖的細(xì)胞基因計數(shù)矩陣探索和過濾數(shù)據(jù)，輸出的csv文件就可以使用R的seurat包進(jìn)行下游分析啦。

下一回就到了激動人心的實操環(huán)節(jié)啦，不要走開，后續(xù)更精彩喲。

小果今天的分享就到這里，歡迎大家和小果一起討論學(xué)習(xí)哦！我們下期再見~

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