不同之處歡迎討論。

1.準(zhǔn)備工作：

實(shí)驗(yàn)開始前，將無菌培養(yǎng)瓶，15ml 離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺(tái)，以紫外線照射 30min。（這個(gè)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室情況來，懂的都懂哈哈哈。）

水浴箱調(diào)節(jié)至 37 度恒溫。取細(xì)胞完全培養(yǎng)基。

消毒雙手和超凈臺(tái)。取約 10ml 細(xì)胞完全培養(yǎng)基放于 15m 離心管中。

實(shí)驗(yàn)前備冰盒，快速由液氮中取出凍存的細(xì)胞，置于冰盒內(nèi)。然后迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱到37 度的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化，注意管口處高于水面，以免進(jìn)入導(dǎo)致污染。整個(gè)解凍過程最好在 1 min以內(nèi)，以防融化過程中產(chǎn)生大量冰晶損傷細(xì)胞，約 1min 后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精噴拭凍存管的外壁，立即拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

2.以無菌槍頭吸取細(xì)胞凍存液，置于已放入細(xì)胞完全培養(yǎng)基的離心管中，上下吹打 5 次,使凍存液與完全培養(yǎng)基充分混勻，盡量減少凍存液中 DMSO 的濃度，減輕細(xì)胞損傷。以封口膜封好管口。

關(guān)于DMSO：細(xì)胞凍存液應(yīng)按照無血清培養(yǎng)基、血清、DMSO 的比例為 7:2:1 配置（這個(gè)也是根據(jù)恁實(shí)驗(yàn)室的傳統(tǒng)來。），其中加大凍存液中血清的比例對(duì)于保存某些脆弱的干細(xì)胞以及一些比較珍貴的細(xì)胞很有好處。凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時(shí)配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞。后續(xù)的換液中會(huì)逐漸出去，非特殊情況一般解凍后不需要特意除去。

配平離心:采用天平配平兩端，500rpm，室溫離心5min（有需要的這步后可計(jì)數(shù)。）

3.離心后，吸棄上清液，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。向離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀加入 1ml 細(xì)胞完全培養(yǎng)基，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，吹打過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡。后將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)皿中，繼續(xù)加入9ml細(xì)胞完全培養(yǎng)基，蓋上皿蓋搖勻，12h左右顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，換液。

注意事項(xiàng)：

細(xì)胞復(fù)蘇過程中需要注意以下細(xì)節(jié)：

1. 取凍存管要做好保護(hù)措施，防止細(xì)胞凍存管漏入液氮，導(dǎo)致爆炸。

2. 解凍速度要快，在常溫下，凍存液中的 DMSO 對(duì)細(xì)胞的毒副作用較大，因此必須在一到兩分鐘內(nèi)使凍存液完全融化。

3. 細(xì)胞貼壁少時(shí)，一般凍存細(xì)胞解凍時(shí) 1ml 細(xì)胞液要加 10ml－15ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入過多會(huì)造成細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。

4. 一次復(fù)蘇細(xì)胞不宜過多，細(xì)胞在解凍時(shí)，水浴鍋內(nèi)凍存管太多容易導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。

5. 正規(guī)來說，需要迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。