單細胞測序流程（二）：單細胞測序的文庫制備
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本文書接上回【單細胞流程教程（一）：什么是單細胞】，既然已經(jīng)介紹了單細胞測序的原理、方法和應(yīng)用，本節(jié)跟著小果一起來學習單細胞測序的文庫制備吧。
根據(jù)測序平臺和測序方法的不同（一般都是pair-end），RNA序列（reads）一般都來源于轉(zhuǎn)錄本的3’端（pair-end也讀5’端），或來源于全長轉(zhuǎn)錄本（Smart-seq）。
3’端測序和全長轉(zhuǎn)錄本測序的優(yōu)點如下：
3’端測序：
有獨特的barcode區(qū)分不同的細胞，用UMI確定單個cDNA在擴增過程中產(chǎn)生的拷貝數(shù)
可以較好地區(qū)分細胞類型
成本低
適合用于結(jié)果大于一萬個細胞的樣品
全長測序：
可以檢測異構(gòu)體的表達差異
可以鑒定等位基因的表達差異
可以對少數(shù)細胞進行更深度的測序
適合用于細胞數(shù)量少的樣品
3’端測序和全長測序具有相似的建庫流程和分析步驟，因此下面小果以3’端測序為例跟大家一起學習單細胞測序的建庫流程。
在單細胞測序中，凝膠微珠是其核心組成部分之一。凝膠微珠結(jié)構(gòu)主要包括TruSeq Read 1，10× barcode，UMI以及Poly(dT)。
TruSeq Read 1是測序引物。
10xbarcode是一段含有16個堿基的序列，不同微珠未定不同barcode，可以區(qū)分不同的細胞。
UMI是一段含有12個堿基的序列，在cDNA進行PCR擴增前引入的序列，可以確定cDNA擴增過程產(chǎn)生的拷貝數(shù)。
Poly(dT)序列與mRNA的PolyA尾巴結(jié)合，逆轉(zhuǎn)出cDNA。
磁珠通過微流控系統(tǒng)與細胞混合，形成油包水液滴，具體步驟如下圖所示，
在上述步驟中形成的液滴中，磁珠上的DNA序列與mRNA互補配對，在酶的作用下發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄。
隨后將液滴破碎獲得單鏈cDNA，以cDNA為模板進行擴增、質(zhì)檢、建庫等操作。
由于二代測序的讀長限制，將質(zhì)檢合格后的cDNA通過超聲打碎成二三百bp的片段，添加P5、P7、sample?index、i5、i7序列，完成建庫操作。
以上就是單細胞測序建庫流程以及基本的原理。關(guān)于單細胞測序更詳細的原理可以參考下面加州大學的視頻。歡迎大家繼續(xù)關(guān)注小果，小果將繼續(xù)為大家?guī)韱渭毎麥y序的分析流程。
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