? ? ? ?大家好，今天跟大家分享的是西安交通大學趙永席教授課題組于今年 1 月份發(fā)表在 JACS 上的文章，題目是“Differentiated Visualization of Single-Cell 5?Hydroxymethylpyrimidines with Microfluidic Hydrogel Encoding”。

? ? ??基因組中除了四個經(jīng)典堿基外，還包含化學修飾的DNA堿基。其中 5-甲基胞嘧啶及其氧化衍生物 5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）等已為人們熟知，而胸腺嘧啶的修飾及其生物學功能仍有待探究。5-羥甲基尿嘧啶（5hmU）是胸腺嘧啶的衍生物，由于其在細胞中含量低且與 5hmC 結(jié)構相似，5hmU 的特異性識別和標記以及單細胞中5hmU和5hmC的同時分析仍是挑戰(zhàn)。
? ? ? ?本文報道了一種微流控水凝膠編碼技術，可實現(xiàn)單細胞中5hmU和5hmC差異可視化。方法流程如圖 1所示。首先通過液滴微流控技術分散細胞，裂解后的單細胞及其基因組DNA包裹于單個瓊脂糖微凝膠中。然后對5hmU和 5hmC進行標記，先用硫代磷酸酯特異性標記 5hmU，再用疊氮葡萄糖標記 5hmC。標記后的堿基通過化學交聯(lián)分別編碼到各自的DNA條碼引物中。原位擴增反應和熒光探針分子實現(xiàn)單細胞中5hmU和5hmC的可視化。最后利用機器學習算法對微凝膠中的5hmU/5hmC四維特征進行解碼，實現(xiàn)非致瘤性、癌性和高侵襲性乳腺細胞株的區(qū)分。

? ? ? 作者首先證明了 5hmU 識別和標記的特異性， 具體如下。首先LC-MS/MS測定T4噬菌體β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（T4β-GT） 標記后分解的核苷， 結(jié)果如圖 2A所示，含有5hmU:A的dsDNA基本沒有糖基化5hmU核苷，而5hmU:G 和5hmC:G樣品標記后生成大量糖基化核苷，證明T4β-GT能有效地將疊氮葡萄糖基轉(zhuǎn)移到5hmU:G中。接著通過 DNA 解鏈反應和加入 SH-活性試劑（圖 2B），證明5hmU可被 5hmU DNA 激酶（5-HMUDK） 和腺苷-5-O-硫代三磷酸（ATP-γ-S） 特異性識別和標記。

? ? ? 為了得到分散的單細胞并對 5hmU 進行標記，作者設計了一種兩股同流液滴芯片， 通過細胞懸浮流與熔融的瓊脂糖流合并，將單個細胞包裹進瓊脂糖微凝膠中。實驗條件下，97%的positive液滴只含有一個細胞（圖 3A）。在瓊脂糖冷卻和凝膠化后，油相微凝膠被轉(zhuǎn)移到水相。微凝膠與 5-HMUDK 和 ATP-γ-S 孵育，標記 5hmU為 5psmU， 5psmU與 5’端修飾的 DNA 引物反應， 該引物可用于滾環(huán)放大（RCA） 反應，產(chǎn)生長的單鏈 DNA 連環(huán)體。該連環(huán)體可捕獲多個熒光探針分子，用于信號放大（圖 3B）。單個細胞中 5hmU位點的數(shù)量可通過對微凝膠中的斑點進行計數(shù)來粗略評估。

? ? ? 接下來 T4 β-GT 標記 5hmC引入疊氮基團，疊氮基團與5′ DBCO 修飾的DNA引物交聯(lián)，然后進行RCA反應。選擇三種人乳腺上皮細胞系進行實驗， 如圖 4 所示， 使用單個微凝膠的熒光強度來大致描述這兩種堿基在不同細胞系中的豐度。盡管存在顯著的單細胞異質(zhì)性，MCF-7的平均值均高于MCF-10A和MDA-MB-231。還進行了兩個熒光通道的共定位分析，以研究 5hmU 和 5hmC在基因組DNA中的位置關系。在這些細胞系中觀察到不同且較高的共定位速率。

? ? ? 此外作者還嘗試通過5hmU和5hmC信號（熒光強度和斑點數(shù)）鑒別非腫瘤細胞和腫瘤細胞， 如圖 5 所示，常規(guī)方法難以區(qū)分三種細胞系。后利用深度學習自動編碼器、機器學習t-分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）和主成分分析（PCA）等降維算法，分別對二維空間中的原始數(shù)據(jù)進行可視化。如圖 5 所示， t-SNE 算法性能最優(yōu)，可區(qū)分三種細胞系。

? ? ? 綜上，作者首次使用硫代磷酸酯和DNA條碼技術對5hmU位點進行了特異性標記，并結(jié)合液滴微流控技術和DNA擴增技術，實現(xiàn)了微凝膠包裹的單細胞中5hmU和5hmC的差異可視化分析。

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.9b11393。