肺癌是致死率最高的癌癥類型，其中80%至85%的肺癌屬于非小細胞肺癌（NSCLC）亞型。PD-L1治療可以顯著提高NSCLC患者生存率，然而絕大部分NSCLC患者對PD-L1的單一藥物治療沒有反應。在以往的研究中，都是以T細胞作為預測PD-L1免疫療法的預后標志物，而Genentech公司的Romain Banchereau和David S. Shames領銜的研究團隊利用單細胞轉錄組結合bulk RNA-seq聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)漿細胞可以作為非小細胞肺癌中PD-L1抑制劑（阿替唑單抗）治療預后的預測標志物。其研究成果：“Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer”發(fā)表于Cancer Cell期刊。

研究材料

192名隨機II期臨床試驗（POPLAR）中接受阿替唑單抗治療（n=96）或多西紫杉醇化療（n=96）患者的非小細胞肺癌（NSCLC）FFPE組織；

699名隨機III期臨床試驗（OAK）中接受阿替唑單抗治療(n=350)或多西紫杉醇化療(n=349)患者的非小細胞肺癌（NSCLC）FFPE組織；

三個獨立的NSCLC患者單細胞轉錄組數(shù)據(jù)集；

29例人非小細胞肺癌（NSCLC）組織：轉移性淋巴結（mLN）、非轉移性淋巴結（nLN）、正常癌旁組織（nLung）、腫瘤活檢（Tbio）和腫瘤切除（T res）。

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技術路線

步驟1：Bulk-RNA數(shù)據(jù)分析與阿替唑單抗治療的患者總體生存（OS）改善顯著相關的B細胞特征；

步驟2：通過對NSCLC樣本進行單細胞轉錄組測序（scRNA-seq），識別腫瘤內(nèi)不同B細胞的轉錄組特征，并驗證了分析結果；

步驟3：scRNA-seq聯(lián)合bulk-RNAseq分析目標B細胞特征；

步驟4：確定高漿細胞特征與阿替唑單抗治療后的患者生存率的關系；

步驟5：確定漿細胞特征在具有三級淋巴結構(TLS)和/或淋巴聚集（LAs）的腫瘤中富集。

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研究結果

1. 阿替唑單抗治療患者的B細胞轉錄特征與患者生存率改善相關

為了探究阿替唑單抗治療患者的內(nèi)在特征與患者生存率的關系，研究者對OAK隨機III期臨床試驗中接受阿替唑單抗治療后受益患者和無受益患者進行常規(guī)轉錄組測序分析。結果發(fā)現(xiàn)，受益患者中與B細胞（漿細胞）相關的基因高表達，如CD79A、CD19等（圖1 A），然而在化療組中這些基因表達均不顯著（圖1 B），表明這些基因對阿替唑單抗治療的效果具有預測價值。為了驗證這一價值，研究者在OAK隨機III期臨床試驗中進行了生存分析，發(fā)現(xiàn)B細胞標記物CD79A和CD19的高表達與IFNG或IFN誘導的趨化因子CXCL10相比，更顯著的改善了患者總體生存率（圖1 C-F）。

2. 單細胞轉錄組數(shù)據(jù)確定B細胞亞群表達特征

為了進一步研究與阿替唑單抗治療相關的B細胞表達特征，研究者對44例NSCLC患者的肺和外周組織進行了單細胞轉錄組測序。經(jīng)實驗分析共捕獲208506個細胞，確定了三個主要 B細胞亞群，包括濾泡B細胞、生發(fā)中心B細胞和漿細胞（圖2A）。濾泡B細胞高表達CD83、CD69、SELL和BANK1；漿細胞高表達多種免疫球蛋白轉錄物（IGHG2、IGHGP和IGHA2）、MZB1、DERL3和XBP1；生發(fā)中心B細胞高表達HMGA1、AICDA和RGS13（圖2C）。在兩個獨立的NSCLC的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中驗證了這三類細胞的存在（圖2D和2E），并使用CyTOF在蛋白質水平上進一步證實了這三個B細胞亞群的存在。

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3.?高度特異性的漿細胞表達特征可用于bulk RNA-seq分析

為了探究scRNA-seq分析中確定的B細胞亞群表達特征是否可以預測阿替唑單抗治療或多西紫杉醇化療后的患者生存率（OS）。研究者首先通過基因共表達分析和層次聚類結果，發(fā)現(xiàn)單細胞轉錄組分析確定的B細胞亞群表達特征可以應用于bulk RNA-seq數(shù)據(jù)分析（圖3 A）。又對23例NSCLC腫瘤組織進行了配對的bulk RNA-seq和mIF分析（圖3 B），結果發(fā)現(xiàn)，RNA-seq或mIF對漿細胞的定量具有高度相關性（圖3 C）；對樣本進行二分后得到了相似的分層（圖3D）。此外只有漿細胞的標記基因與mIF漿細胞定量相關，而濾泡B細胞和生發(fā)中心B細胞的標記基因與mIF定量不相關。以上結果證明了單細胞轉錄組分析確定的B細胞表達特征中的漿細胞具有高度特異性，并能應用于bulk RNA-seq來對樣本進一步分層。

4. 高漿細胞特征預測阿替唑單抗治療后的患者生存率增加

然后，研究者使用三分位數(shù)對患者進行二分類，通過Kaplan-Meier對T3類和T1/2類進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn)，雖然阿替唑單抗在三個B細胞特征中都觀察到OS改善的趨勢，但只有漿細胞信號顯著（圖4A-4D）；并且無論是生發(fā)中心B細胞、濾泡B細胞，還是tGE8特征（IFNG、 CXCL9、CD8A、GZMA、GZMB、CXCL10、PRF1和TBX21），都在這些模型中不顯著（圖4E）。

為了進一步評估漿細胞特征對免疫檢查點抑制劑治療反應的預測價值和獨立性，研究者對207名患者（阿替唑單抗 n=99；多西紫杉醇 n=108）采用PD-L1 IHC、RNA-seq和組織TMB進行了全面的生物標記物分析，并與多因素Cox比例風險分析相結合。結果發(fā)現(xiàn)，漿細胞特征對阿替唑單抗治療組中的OS有最強的影響，且高漿細胞特征的腫瘤患者僅在阿替唑單抗治療組中臨床獲益率顯著增加（圖4H），而在多西紫杉醇化療組中沒有這些相關性，這突出了漿細胞特征的特異性（圖4F）。

5. 漿細胞特征在具有三級淋巴結構(TLS)和/或淋巴聚集（LAs）的腫瘤中富集

前人在TLS中發(fā)現(xiàn)了腫瘤內(nèi)B細胞。因此，研究者評估了基線腫瘤H＆E玻片中TLS或淋巴聚集物（LAs）的存在情況，并通過RNA-seq和mIF比較TLSs和LAs在細胞表型水平上的差異。結果發(fā)現(xiàn)，TLS以CD20+ B細胞為主的獨特生發(fā)中心為標志，其中生發(fā)中心被CD20+ B細胞和CD3+ T細胞的混合物包圍（圖5A）。此外，所有已識別的TLS均由鄰近的漿細胞標記，并在LAs內(nèi)或周圍也發(fā)現(xiàn)漿細胞（圖5A）。為了進一步探究漿細胞與其他細胞類型之間的關系，研究者進行了mIF實驗，實驗證明漿細胞浸潤可能與TLS或LAs中的T細胞浸潤有關。

研究者又進一步探究在POPLAR隨機II期臨床試驗中腫瘤的H&E玻片是否存在TLS和/或LAs。結果發(fā)現(xiàn)，在254例患者樣本中，9%的患者有TLS樣結構，21%的患者有LAs；并發(fā)現(xiàn)含有TLS和/或LAs的腫瘤患者在使用阿替唑單抗治療時，OS有顯著增加，但使用多西紫杉醇化療時沒有顯著區(qū)別（圖5C）。這表明TLS和/或LAs的存在與阿替唑治療（而非多西紫杉醇化療）患者的OS獲益密切相關，這一特征與漿細胞特征相似。研究者又對TLS/LA+和TLS/LA-的腫瘤組織進行了DE-Gs分析，發(fā)現(xiàn)含有TLS和/或LAs的腫瘤中三種瘤內(nèi)B細胞亞群的基因高度富集，尤其是漿細胞基因，包括MZB1、TNFRSF17（BCMA）和免疫球蛋白（圖6A和6B）。對三種B細胞特征的定量分析證實了TLS和/或LAs的腫瘤中漿細胞數(shù)量增加（圖6C）。

小編小結

總的來說，該研究整合了阿替唑單抗免疫檢查點抑制劑治療與多西紫杉醇化療兩個大型隨機臨床試驗的bulk RNA-seq隊列，以及scRNA-seq和蛋白質測量實驗，結果表明，NSCLC中高水平的瘤內(nèi)漿細胞與接受阿替唑單抗治療的患者更長的OS密切相關，可以作為一種新的免疫檢查點抑制劑治療的預后標志物。