基因功能研究，尤其是在細胞系的基因功能研究，通常是從三板斧開始的，基因干擾、基因過表達、基因敲除，今天我們來講講，最耀眼的基因敲除！

想必大家都聽過，基因敲除和基因干擾因為很相似，往往被不明就里地混用，但實際上基因干擾只是在轉(zhuǎn)錄后水平上的降低基因表達，并不能像基因敲除那樣完全地把基因從基因組中剔除，有時候也會因為背景不干凈，導(dǎo)致產(chǎn)生的表型難以分析，如果是干擾實驗，蛋白表達降不下去，表型差異出不來，就只能做敲除咯

江湖上一直流傳著4+2的傳說，4是四種技術(shù)手段（蛋白法、常規(guī)瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒法、病毒法、Virus-Free?穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒法），2是兩種gRNA設(shè)計策略（移碼敲除、片段敲除），親自動手的科研"汪"，或者服務(wù)公司從4+2中混搭形成了自己的風(fēng)格，十八般武藝，分外熱鬧。

新人小白們，面對著4+2的江湖，內(nèi)心是崩潰的。師兄說蛋白法好 見效快 干凈無殘留；師姐告訴你 病毒法好 省事又高效；導(dǎo)師也有建議 說別搞那些幺蛾子 瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒價格便宜 還能藥篩；實驗方法讓人撓頭，敲除策略也不省心，A公司做移碼敲除 說高效快捷成功率高，B公司做片段敲除 說穩(wěn)定省心WB干凈……

我們就來盤點一下這個4+2的江湖，評一評這十八般武藝

4種基因敲除的技術(shù)手段

總的來說，蛋白法不需要構(gòu)建載體，最快捷，但是sgRNA容易降解，操作難度大，一般更多應(yīng)用于點突變和定點插入；常規(guī)瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒法構(gòu)建簡單，但是效率低；病毒法效率高，但是周期長，成本更高；Virus-Free?穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒法穩(wěn)定整合而不需要包病毒，效率高周期短，是一種很好的替代病毒的方法。

兩種gRNA設(shè)計策略

這是基因敲除通用的兩種方法，都能實現(xiàn)基因功能的沉默。

移碼敲除效率高，設(shè)計簡單，但是后續(xù)蛋白檢測風(fēng)險較大，往往會出現(xiàn)WB敲除不干凈的現(xiàn)象，導(dǎo)致敲除變干擾；片段敲除需要雙gRNA同時起作用，效率較低，但是后續(xù)蛋白檢測背景干凈，結(jié)果有保證，更好發(fā)文章。

結(jié)語：

4+2如何選擇，取決于最終目的和周期成本預(yù)算，也取決于不同細胞不同基因的類型。有位不知名的技術(shù)專家X man說過，“像293這種細胞，我閉著眼隨便做，都能拿到一堆純合子”。

最后，小海星寫得這么用心，必須要打個小廣告咯，對于大部分細胞系的基因敲除來說，我們的Virus-Free?轉(zhuǎn)座子技術(shù)結(jié)合片段敲除策略，應(yīng)該是這個江湖中性價比最高的一把斧頭了。

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