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最基礎(chǔ)的細胞實驗:細胞增殖檢測-軟瓊脂克隆實驗

2023-07-31 16:39 作者:無錫耐思NEST  | 我要投稿

軟瓊脂克隆形成實驗

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實驗(Anehorage-independentassay)。利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質(zhì),使細胞在懸浮狀態(tài)下生長。軟瓊脂克隆形成實驗方法簡單,適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系。


操作流程

1.提前配置1.2%和0.7%瓊脂(Agarose 加蒸餾水配置),高壓滅菌后4攝氏度冰箱保存。鋪板當天微波爐或烘箱加熱融化,置于37攝氏度培養(yǎng)箱中。

2.鋪下層膠:按1:1比例混勻1.2%Agarose和20%1640,6孔板每孔取2mL混合液,在室溫條件下等待冷卻凝固。

3.取對數(shù)生長期細胞,消化配置成單細胞懸液,計數(shù)后將細胞數(shù)調(diào)整為5*10^4/mL。

4.鋪上層膠:按1:1比例使0.7%Agarose和20%1640培養(yǎng)基混勻,取2mL混合液于EP管中,向管中加入10-20微升細胞懸液,充分混勻后加入已鋪下層膠的6孔板中,待上層瓊脂凝固后,放在37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周,每三天向孔板中加入200微升培養(yǎng)基。

5.顯微鏡下拍照,統(tǒng)計克隆直徑并作圖。


以下述為例:

116-con:1.2*10^6

116-OE:1.1*10^6

將細胞配置成5*10^4/mL

116-con:42+958培養(yǎng)基

116-OE:45+955培養(yǎng)基

注意事項

1.細胞一定要吹打分散成單細胞懸液

2.接種時細胞密度不可過高

3.軟瓊脂與細胞混合時溫度不可超過40攝氏度,容易燙傷甚至燙死細胞。

4.軟瓊脂對熱和酸不穩(wěn)定,反復加熱容易降解并產(chǎn)生毒性,且容易造成硬度下降,因此需要高壓滅菌后進行分裝。

5.鋪板操作時速度要快,以免造成局部凝固。

耗材:


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